По мере прогрессирования нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона и Альцгеймера, неправильно свернутые белки собираются вместе в нейронах, рекрутируя нормальные белки в клетке, чтобы также неправильно складываться и агрегироваться. Клетки, в которых это происходит, дегенерируют и в конечном итоге умирают. Возможность следить за местонахождением этих поврежденных белков является ключом к раскрытию этих болезней и разработке лекарств.
Команда исследователей разработала набор инструментов для наблюдения, мониторинга и количественной оценки того, как неправильно свернутые белки, связанные с болезнью Паркинсона, попадают в нейроны в лабораторных культурах, и что с ними происходит, когда они оказываются внутри. Результаты будут опубликованы в августе. 11 номер журнала биологической химии.
Альфа-синуклеин – это белок, обнаруженный во всех нейронах, и считается, что он участвует в регуляции высвобождения нейромедиаторов. Неправильно сложенный альфа-синуклеин слипается, образуя фиброзные отложения, называемые амилоидными фибриллами. Это основные компоненты телец Леви, массы, наблюдаемые в нейронах пациентов с болезнью Паркинсона.
В 2011 году группа Вирджинии Ли в Центре исследований нейродегенеративных заболеваний при Университете Пенсильвании показала, что если лабораторные фибриллы альфа-синуклеина добавить к нейронам, растущим в чашке, в нейронах разовьются тельца Леви и появятся другие симптомы нейродегенерации. Это и другие исследования показали, что неправильно свернутый альфа-синуклеин может распространяться от клетки к клетке, а не образовываться заново в каждой отдельной клетке. Однако не было возможности напрямую наблюдать начальные этапы проникновения фибрилл альфа-синуклеина в клетки.
«Наше понимание нейродегенеративного заболевания – или даже нормальной функции здорового мозга, если на то пошло – ограничено методами, которые мы сейчас имеем в своем распоряжении», – сказал Ричард Карпович-младший., постдок в лаборатории Ли, который руководил новым исследованием.
Карпович разработал простой, но чувствительный метод визуализации фибрилл альфа-синуклеина, проникающих в клетки. Сначала он культивировал нейроны и синтезировал фибриллы альфа-синуклеина, помеченные флуоресцентными белками. Затем он поместил клетки и флуоресцентные фибриллы в чашку вместе. Затем он добавил краситель под названием трипановый синий, который отключает флуоресцентные метки. Важно отметить, что этот краситель не может проходить через неповрежденные клеточные мембраны, а это означает, что он не может отключить метки, которые уже находятся внутри клеток. Как только он добавил краситель, светящиеся фибриллы за пределами клеток погасли, но те, что уже вошли в клетку, продолжали светиться, что позволило ему визуализировать и подсчитать интернализованные фибриллы.
Кроме того, в сотрудничестве с E. Исследовательская группа Джеймса Петерсона на химическом факультете Пенсильванского университета также разработала фибриллы, помеченные долговечными флуоресцентными метками, которые были либо чувствительны, либо нечувствительны к кислотности. Основываясь на том, была ли флуоресценция видимой, исследователи могли определить, когда фибриллы вошли в кислые компартменты клетки, что позволило им определить клеточные процессы, которые воздействовали на фибриллы.
Используя эти методы, команда смогла получить несколько сведений о судьбе фибрилл, попадающих в клетки. Они обнаружили, что фибриллы активно поглощаются клеточной мембраной и транспортируются в лизосомы, отделение утилизации клеточных отходов, где большая часть фибрилл остается в течение нескольких дней. «Удивительно, насколько клетка способна изолировать», – сказал Карпович. Но, несмотря на все усилия клеток, некоторые фибриллы вышли из лизосом и вызвали агрегацию белков.
Когда исследователи добавляли хлорохин в клетки для подавления лизосомальной активности, все больше и больше нативного альфа-синуклеина привлекалось для образования агрегатов. Лизосомальная дисфункция часто наблюдается у пациентов с нейродегенеративными заболеваниями. «Мы знаем, что некоторые [патологические белки] каким-то образом выходят из лизосом», – сказал Ли. “Но мы не знаем, как это происходит.”
Но возможность точно определить количество поглощенных фибрилл позволит исследователям быстро проверить потенциальные фармакологические соединения, которые однажды могут быть использованы для остановки распространения поврежденных белков у пациента. «Как только вы сможете посмотреть на поглощение [фибрилл] клеткой и количественно определить, сколько их содержится внутри клетки, тогда вы сможете добавить к ним небольшие молекулы, чтобы увидеть, сможете ли вы снизить поглощение», – сказал Ли. “Это действительно простой анализ и не занимает много времени.Карпович добавил, что изучение генетической изменчивости этих путей поглощения может дать намек на то, почему одни люди более восприимчивы к болезни, чем другие.